《食品科学》：东北农业大学张微副研究员等：CRISPRCas-等温扩增技术在食源性病原菌检测中的研究进展
食品安全是目前全世界各国都面临的公共问题之一。在每年报道的食品安全事件中，由食源性病原菌所引起的食物中毒事件占45%。随着食源性病原菌检测技术不断发展，从最早期的传统检测手段开始，已发展出多种新型检测技术。簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）及其关联蛋白（Cas）组成的CRISPR/Cas系统凭借自身新颖的反式切割活性进行信号放大，被称为“下一代分子诊断技术”。然而，在没有预扩增的情况下，CRISPR/Cas系统难以产生单个灵敏的检测信号，这限制了其在食源性病原菌检测中的应用。现有检测技术存在一定劣势，亟待新兴检测技术的出现及应用，因此，将CRISPR/Cas系统与等温扩增技术相结合，可以作为病原菌的快速检测手段。
东北农业大学食品学院的张琪、庞立冬、张微*等人对CRISPR/Cas和等温扩增技术组合的快速检测方法进行综述，概述CRISPR/Cas系统的分类以及该系统与等温扩增结合后在食源性病原菌检测方面的研究进展。进一步对纳米材料和功能核酸（FNAs）介导的信号输出方式在CRISPR/Cas-等温扩增组合中的应用进行相应的归纳。最后，展望并分析CRISPR/Cas-等温扩增组合在食品安全控制应用中面临的挑战和未来前景，以期为该技术的推广与应用建立一定基础。
CRISPR/Cas系统是存在于细菌和古细菌中的一系列防御机制，最早在大肠杆菌中被发现。这种防御机制的基本原理是入侵因子如病毒、质粒等衍生的短片段被捕获并整合到CRISPR序列位点中建立遗传记忆，随后将这些DNA转录加工成成熟的CRISPR RNA（crRNA）作为向导RNA，与Cas效应蛋白组装后形成的复合物可以特异性识别并切割与crRNA互补的靶标序列，从而使细菌能更好地识别并防御外来入侵因子的侵害。凭借这一优势，CRISPR/Cas系统成为一种灵活的基因编辑工具。
在目前的研究中，根据Cas效应蛋白的不同可将CRISPR系统分为2 类：第1类是具有多亚基效应子的系统，每种效应蛋白在CRISPR生物传感系统中发挥单一作用，第2类是具有单效应子的系统，每种效应子在系统中发挥多种功能。Cas效应蛋白具体可分为6 种类型（I～VI），第1类包括I型、III型、IV型，第2类包括II型、V型和VI型。目前，所应用的CRISPR/Cas系统多数基于II型的Cas9、V型的Cas12、Cas14和VI型的Cas13效应蛋白，其可高效完成靶标序列的识别和切割，已被广泛应用于生物传感领域。其中V、VI型Cas效应蛋白具有反式切割活性，即效应蛋白的切割活性一经激活后可以以极高的活性切割任意序列的单链DNA（ssDNA），利用这一特性CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13及CRISPR/Cas14系统已被开发成高灵敏度核酸检测工具。根据Cas效应蛋白特性的不同，用于病原菌快速检测的CRISPR/Cas系统可分为3 种类型：1）当靶标物质存在时，向导RNA可特异性地对靶标物质识别并结合进行检测，此类CRISPR系统所依赖的Cas效应蛋白通常具有特异性识别并捕获靶标的功能而不表现核酸酶切活性，如Cas9蛋白的突变体dCas9；2）当靶标物质存在时，向导RNA激活Cas效应蛋白对靶标物质的切割活性，对其进行特异性识别并切割，以达到快速检测的目的，此类Cas效应蛋白包括Cas9及其突变体Cas9nD10A；3）当靶标物质存在时，向导RNA将激活Cas效应蛋白的切割活性，引导效应蛋白对非靶标物质进行切割，这类CRISPR系统常用的效应蛋白为Cas12a、Cas13a和Cas14a。
CRISPR/Cas9系统作为第1个用于真核生物细胞基因编辑的CRISPR平台，Cas9效应蛋白在其中充当核酸内切酶的角色，包括HNH和RuvC 2 个核酸酶结构域，由反式激活crRNA（tracrRNA）和crRNA赋予其切割双链DNA（dsDNA）的功能，并且tracrRNA与crRNA可连接成单一向导RNA（sgRNA）。在识别DNA时，目标序列下方需要有一个特定的短DNA序列片段，称为原间隔相邻序列（PAM）。Cas9通常识别富含G的PAM，保障不会切除自身DNA，因此特性，其参与防止自身免疫疾病的机制。sgRNA作为Cas9的向导RNA，与Cas9结合使其产生活性，通过HNH结构域可切割位于PAM上游3 bp处与crRNA互补的DNA链；通过RuvC结构域可切割位于PAM上游3～8 bp处与crRNA非互补的DNA链。研究人员还通过对HNH和RuvC 2 种催化结构域进行突变形成Cas9n和dCas9 2 种蛋白突变体，其中CRISPR/Cas9n系统用于基因编辑可大幅降低脱靶活性。
与Cas9相似，Cas12效应蛋白在CRISPR系统中也充当核酸内切酶的角色，近几年逐渐成为Cas9的替代品用于基因编辑。Cas12可以识别并切割与富含T的PAM序列相邻的靶标dsDNA，凭借这一特点在多重基因编辑方面得到广泛应用。Cas12效应蛋白包括Cas12a和Cas12b，其中Cas12a来自V-A-CRISPR系统，又称为Cpf1，Cas12b来自V-B-CRISPR系统，又称为C2c1。常用的Cas12a通常由单个crRNA作为向导RNA，Cas12b则需要tracrRNA和crRNA同时引导。此外，Cas12a和Cas12b的核酸结构域也有不同：Cas12a的核酸结构域为RuvC和Nuc，Nuc结构域不直接影响靶DNA，而是协助RuvC间接起作用；Cas12b的核酸结构域仅为RuvC。
Cas13效应蛋白是近几年发现的，与Cas9和Cas12不同的是，Cas13仅可靶向识别并切割单链RNA（ssRNA），由于其没有RuvC结构域，不具备DNA酶活性，对于dsRNA、ssDNA和dsDNA无靶向识别和切割功能。Cas13效应蛋白也分为Cas13a（被称为C2c2）和Cas13b 2 种亚型，其中Cas13a较为常用。二者在切割底物机制方面存在一些差异，Cas13a仅需要crRNA作为向导RNA，能够在没有tracrRNA的情况下识别含有前间隔侧翼序列（PFS）的位点，通过2 个结构域HEPN切割RNA，显示其非特异性反式切割活性。目前Cas13b的作用机制尚未研究成熟，但部分研究显示，与Cas13a相比，Cas13b在RNA编辑方面更为精确，可由成熟的crRNA辅助识别PFS位点，从而进行非特异性的RNA切割。
Cas14是近几年发现的新兴效应蛋白，与其他效应蛋白相比，Cas14仅由400～700 个氨基酸组成，几乎是其他效应蛋白体积的一半。Cas14效应蛋白作为由RNA引导的DNA核酸酶，可在crRNA和tracrRNA的指导下通过RuvC识别并切割ssDNA，正是由于Cas14效应蛋白极小的体积，在切割ssDNA时不需要特定的PAM序列，对于DNA的单核苷酸多态性（SNP）的特异性更高。此外，在识别靶标DNA的同时也展示了其对ssDNA的附带切割活性，这些特征使Cas14效应蛋白在生物传感方面展现出更大的优势，在未来的研究中不仅可以用于基因组工程，还可用于病毒筛选及病原体检测等相关平台。
CRISPR/Cas系统作为一种可特异性识别靶标序列并具有催化信号放大功能的检测技术，可直接用于靶标序列的检测。但目前的研究中仍需要对靶标序列进行扩增才能使检测灵敏度达到要求。在进行检测时一般需要核酸提取、核酸扩增、信号生成及信号输出4 个步骤。因此，需要将CRISPR/Cas系统与核酸扩增技术相结合以提高其检测性能。在POCT领域的应用可分为CRISPR/Cas系统的预扩增和扩增前CRISPR。图1展示了CRISPR/Cas系统结合滚环扩增（RCA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、重组酶辅助扩增（RAA）、环介导等温扩增（LAMP）以及链置换扩增（SDA），并以纳米材料和FNAs为信号输出方式用于食源性病原菌检测的示意图；表1详细概述了不同CRISPR/Cas-等温扩增组合检测不同病原菌时的信号输出方式、灵敏度及线性范围。
为进一步提升检测的灵敏度，检测之前需要对核酸进行预扩增富集靶标分子，之后由向导RNA引导的特定序列特异性地产生扩增检测信号。在近年来的研究中，CRISPR/Cas系统的预扩增已广泛应用于食品安全检测平台。表2描述了常见等温扩增系统的主要特征。
RCA是一种高效的恒温核酸扩增方法，其原理为核苷酸链退火到环状DNA模板上，随后引物在DNA聚合酶的作用下沿着5′至3′的方向通过环状模板的循环扩展而延长。RCA与其他技术相比具有独特的优势，通过设计圆形模板序列，在适配体、DNA酶等的作用下定制所需要的RCA产物，极大拓宽了其应用范围。同时RCA技术凭借自身出色的效率、高效的选择性及其多功能性在生物检测和分析中得到了广泛的应用，尤其是快速诊断和快速检测领域。目前已有研究整合了CRISPR/Cas系统和RCA的优势，开发了高特异性的核酸检测平台。
Chen Zhibao等基于免疫RCA与CRISPR/Cas12a相结合设计一种超灵敏、特异性的大肠杆菌O157:H7电化学生物传感器。在靶标大肠杆菌O157:H7引入生物传感器之后，电化学信号发生变化。在优化条件下该生物传感器灵敏度和检测范围都明显优于之前报道的方法。因此，通过将Cas12a和免疫RCA相结合可以开发出检测病原体的新型超灵敏和特异性生物传感器平台，该生物传感器对实际样品中许多病原菌的检测展示出了优异的性能。
RPA技术于2006年被推出，是等温扩增技术的重大突破，扩增过程主要依赖于重组酶和ssDNA结合蛋白（SSB），其原理为重组酶与寡核苷酸引物结合形成复合体，并使引物与dsDNA中的同源序列相互配对，SSB与DNA链相结合形成稳定的D环，从引物启动，在DNA聚合酶的作用下介导DNA扩增，最后通过重复此RPA循环实现指数扩增。与其他的等温扩增技术相比，RPA扩增速率快，通常30 min内即可完成采集样本的全过程。因其制备要求低、操作温度可控以及所需试剂的商业可用性等优势，已被广泛应用于实验室及相关临床环境中。
近年来研究发现，用于RPA后的检测平台通常需要昂贵的探针设计，灵敏度低、缺乏特异性，需要建立可以与RPA相结合的更为灵敏、特异的检测手段。将CRISPR/Cas生物传感系统与RPA相结合可以提高反应的特异性以及实现信号的新一轮扩增。基于此原理，将RPA作为CRISPR/Cas生物传感系统的前预扩增技术，开发了DETECTR（DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因）系统，该系统可用于检测涉及癌症和传染病诊断的重要生物标志物。目前CRISPR/Cas-RPA技术检测系统已经广泛应用于食源性病原菌的检测中。Wang Pei等提出将RPA与CRISPR/Cas12a和荧光分子（ssDNA-FQ）预混合在一个试管中，避免了开盖污染，利用RPA强大的扩增能力和CRISPR/Cas12a精确的切割活化特性开发一种快速视觉检测方法。该平台在30 min内即可完成检测，灵敏度达到10 1 copies，为不同类型的核酸检测提供了参考。除Cas12a外，基于VI型的Cas13a也被用于食源性病原菌的检测。An Bailin等将Cas13a与RPA相结合建立沙门氏菌属检测单管两步反应体系。结果表明，单管RPA-Cas13a的检测灵敏度与实时荧光定量PCR相同，达到10 2 copies/μL；而两步法RPA-Cas13a对沙门氏菌的LOD可达10 0 copies/μL，更适用于低丰度样品。该检测平台可在简单的恒温设备上进行，降低了对设备和操作人员的要求，整个过程控制在13 min内，可作为乳及乳制品中沙门氏菌的快速检测方法，为未来的POCT应用提供思路。
RAA的原理与RPA相似，依赖于从细菌或真菌中所获得的重组酶、SSB和DNA聚合酶。在常温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，通过SSB的帮助打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。这一扩增过程可在30～42 ℃、30 min以内的条件下高特异性地完成。唯一不同的是RPA与RAA酶的来源不同，RPA重组酶来源于T4噬菌体，而RAA重组酶来源于细菌或真菌。RAA采用的来源于细菌和真菌的DNA聚合酶和重组酶相较于RPA具有更高的活性。
CRISPR/Cas生物传感系统已与RAA技术相结合，以检测各种食源性病原体，包括单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌和腐败细菌等。基于CRISPR/Cas-RAA技术的检测系统，如SHERLOCK（specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking）和DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter），已成功用于核酸检测中，实现了多种模式下食品中病原菌的高灵敏度检测。Zhou Chi等开发了基于CRISPR/Cas12a-RAA系统的沙门氏菌定量检测方法，原理如图2A所示。当存在目标物质时，通过CRISPR/Cas12a的活化和切割、酶反应、葡萄糖信号读取，实现了从靶基因到葡萄糖信号的间接转化，该方法检测限低至5 CFU/mL，此外在1～10 3 CFU的范围内实现了沙门氏菌的定量检测。但该方法需要转移扩增产物，增加了操作的复杂性及样品交叉污染的风险。因此Lü Xinrui等设计了一种基于CRISPR/Cas12a-RAA的单管新型检测系统用于检测虾样品中的副溶血性弧菌，原理如图2B所示。该方法在纯培养物中的LOD为67 CFU/mL，在虾样品中的检测限为73 CFU/mL，与之前的方法相比具有更高的灵敏度和特异性。此外，RAA所需的37 ℃的扩增条件也减少了传统PCR扩增时极其微量的污染就可造成假阳性的结果，不到1 h即可完成整个检测过程，不仅极大缩短了检测时间，还可避免复杂热循环仪的使用，满足了副溶血性弧菌检测的需求，为食源性病原菌的检测提供了新思路，对食品安全监管具有重要意义。
LAMP是2000年提出的一种核酸扩增方式，用于多种病原菌的检测，为细菌和病毒的POCT提供了新的方向。其扩增过程需要4 条特异引物，首先，内部引物结合靶标物质，在BstDNA聚合酶的作用下延伸成双链，聚合酶延伸外引物以置换新合成的链，由于F1c和F1区域的杂交，使得位移链在5′端形成茎环结构，在3′端以类似的方式扩增，形成两端具有茎环结构的DNA，靶DNA的重复序列通过连续的延伸和置换进行扩增。由于LAMP技术使用4～6 个特异性引物来识别6～8 个特定区域，更具有特异性和灵敏度。反应时间基本在30 min以内，极大缩短了扩增时间。
然而，单独使用LAMP进行扩增容易造成交叉污染，由非特异性扩增而产生假阳性结果，因此用CRISPR/Cas12a介导LAMP可消除上述缺点，实现食源性病原菌的稳定、灵敏检测。Mukama等利用CRISPR/Cas12a-LAMP测得牛奶中铜绿假单胞菌的灵敏度为10 0 CFU/mL；Kim等也用该联用手段灵敏地检测长叶莴苣中的大肠杆菌O157:H7，灵敏度为10 0 CFU/g。基于此原理，Lee等研发了一种快速、灵敏的基于LAMP-CRISPR/Cas12a的LFB平台，用于检测沙门氏菌视觉化检测。如图2C所示，该平台在不使用预富集培养物的情况下，对纯培养物样品的LOD为1.22×10 0 CFU/mL。这表明该检测平台比常规的检测方法具有更高的特异性和准确性，通过设计适当的目标病原体crRNA可以使该方法应用于多种类别病原菌的检测中，使其成为一种有价值且灵敏的POCT生物传感检测技术。为进一步减少操作过程中的污染，Shi Yaoqiang等开发了一种单管CRISPR/Cas12a增强型LAMP（CRISPR/Cas12a-E-LAMP）方法用于检测肺炎链球菌。该结果可在LED蓝光下实现肉眼可视化，整个过程在40 min内完成，检测限为4×10 0 copies/μL，在开发用于核酸检测的下一代生物传感器方面具有巨大潜力。
扩增前CRISPR 是指当靶标物质存在时，激活CRISPR/Cas效应蛋白的切割活性，再采用等温扩增技术对其切割后的短ssDNA进行扩增以实现信号放大。由CRISPR/Cas系统触发的指数扩增反应目前不仅有效克服了在长DNA或RNA检测中的局限性，而且赋予了传感平台高灵敏度和特异性。与预扩增方法相比，扩增前CRISPR在核酸研究中可减少非特异性扩增，表现出更显著的效率，实现在不同的病原菌中良好的选择性，可作为检测复杂生物样品的高效、便捷的工具。
Zhang Kaixiang等开发出一种新型CRISPR/Cas9切割检测平台，由Cas9裂解dsDNA的切口触发EXPAR反应来进行Cas9切割效率的评估与sgRNA的预筛选，原理如图3A所示。使用这种新开发的扩增方法，该方法可在40 min内定量Cas9的切割活性，实现高效、特异性强的CRISPR/Cas9基因组编辑。该新型生物传感器的开发为后续食源性病原菌相关检测方法提供了新的思路。SDA是近几年发展起来的基于酶促反应的DNA体外扩增技术，由SDA产生丰富的ssDNA激发Cas效应蛋白的反式切割活性，避免用于靶标扩增的复杂引物设计。为进一步提高检测效率和实际样品分析中的性能，已有研究将SDA作为CRISPR之后的扩增手段。Sun Xuan等开发出一种基于UiO9平台的CRISPR/Cas9触发SDA-RCA两步等温扩增检测大肠杆菌O157:H7。如图3B所示，靶毒力基因序列被CRISPR-Cas9系统识别和切割，并触发SDA和RCA循环扩增。反应后，大量产物可以与探针杂交，并通过荧光强度定量检测靶DNA。该方法实现了在温和条件下特异性检测食品基质中大肠杆菌O157:H7，与传统的RCA和SDA方法相比反应效率更高，检测限较低，在其他病原菌检测、食品安全检测等方面也展现了较好的实际应用能力。
纳米材料在开发基于CRISPR生物传感系统方面受到广泛的关注，如上转换纳米颗粒、MBs、QDs、GO和AuNPs等，在生物材料中具有较好的荧光性能，可用于提高目标检测的分析性能，并实现便捷的信号读数。
近年来MBs在分离和检测方法中已得到了广泛的应用，分离速率快，无需昂贵的仪器设备，在生物分子分离和纯化方面表现出优异的性能，将MBs与生物传感器相结合可以极大提高灵敏度。Li Chao等开发了一种采用免疫捕获MBs增强CRISPR/Cas12a-LAMP灵敏度的方法，用于空肠弯曲杆菌的快速视觉检测，原理如图4A所示。该方法在8 min内即可完成检测，LOD低至70 CFU/mL。结果表明，免疫捕获MBs、LAMP和CRISPR/Cas12a系统的结合可以显著提高空肠弯曲杆菌的检测灵敏度和特异性，这种生物传感器也可用于检测生物样品中的其他病原菌，在今后的工作中具有广泛的应用潜力。
与传统的猝灭剂相比，QDs 是一种吸收光谱宽、量子产率高、光稳定性好、荧光寿命长的半导体纳米晶体，具有高荧光猝灭效率，已经基本取代了传统的荧光团。Zhou Baoqing等合成了链霉亲和素（SA）修饰的QDs作为增强荧光信号，设计了一种特殊的靶标捕获探针，以建立基于LFB的CRISPR/Cas12a-RAA重组酶辅助扩增（CRA-LFB）系统。选择稳定性较好的QDs标记LFB表现出更高的灵敏度和更低的背景干扰，提高裸眼分辨率和检测灵敏度。目标细菌的LOD低至5.4×10 2 CFU/mL，基于CRISPR/Cas12a的LFB平台与QDs和ssDNA探针相结合可用于大多数病原体的检测。基于QDs调节信号输出方式的CRISPR/Cas系统还可以与其他的信号放大策略相结合，Liu Yaqi等开发了SDA辅助的CRISPR/Cas12a电化学发光（ECL）生物传感器，用于金黄色葡萄球菌的超灵敏鉴定。该研究制备了卟啉Zr金属有机骨架纳米材料作为核心反应促进剂，增强QDs的反应并放大ECL发射信号。该检测平台表现出理想的检测性能，具有1 fmol/L～10 nmol/L的线 fmol/L。这种基于QDs调节信号输出的CRISPR/Cas-等温扩增检测系统凭借其优异的性能可以基于不同crRNA的设计用于检测不同的病原体和病毒，具有成本低、速度快的优势。
GO纳米材料在生物分子检测领域越来越受到关注，具有大且易于修饰的表面，可以改性与环氧化物羟基、羧基等官能团连接，这些官能团都有助于改变GO的表面特征，并为多种分子提供附着位点，包括蛋白质、DNA、RNA等。这使GO在纳米材料中的多种应用都处于有利地位，具有更好的潜在应用前景，凭借高效的荧光猝灭能力，GO已被应用在基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器中。Cheng Xiaoxue等通过集成CRISPR/Cas12系统和GO的荧光猝灭能力，开发了一种高灵敏度的荧光检测平台。该研究利用Cas12a高效的切割活性与GO优异的猝灭效率调节FRET，实现任何靶标DNA的检测，所提出的策略也可以与其他等温扩增方法相结合，构建灵敏度更高的生物传感器。Wang Liu等基于此原理开发了一种CRISPR/Cas12a-RPA和GO相结合的沙门氏菌视觉检测方法。原理如图4B所示，通过用GO调节FAM-ssDNA的荧光恢复率代替荧光团和猝灭双标记报告基因实现荧光视觉检测，与传统PCR扩增技术相比，检测时间极大缩短。该方法不需要复杂的仪器，除了病原体还可应用于其他目标物质，有效提高检测的分析性能，实现便捷的信号读数，为未来研究CRISPR与纳米材料相结合的高效生物传感平台提供了参考。
AuNPs由于其独特的光电特性而在生物传感领域受到广泛关注。CRISPR/Cas效应蛋白与金纳米颗粒之间相互作用，为CRISPR的POCT提供了更为高效的诊断平台，在其应用方面发挥较大的潜力。涂有高密度生物条形码DNA的AuNPs探针与不同的扩增技术耦合可实现第2轮信号放大，实现了比传统酶联免疫吸附法（ELISA）低1 000 倍的LOD。Cai Qiqi等基于此原理，将生物条形码免疫测定（BCA）、RPA和CRISPR/Cas12a切割集成单个反应系统（称为BCARPA-Cas12a）。如图4C所示，在该系统中，目标细菌被大量条形码AuNPs标记放大信号。使检测系统的荧光在目标细菌存在下显著增加，可以在蓝光下用肉眼选择性地检测个位数水平的鼠伤寒沙门氏菌，LOD为1 CFU/mL。基于CRISPR/Cas12a的生物传感器的应用范围可以从核酸靶标扩展到非DNA靶标。因此，该方法在其他细菌检测、食品安全监测或临床诊断中具有巨大的进一步应用潜力。
FNAs功能多、应用广，是生物传感器中发展最迅速的一个领域。FNAs由能够结合特定靶标（称为适配体）或具有促进化学反应能力的DNA和RNA分子（称为DNA酶和核酶）组成。除核酸材料的基本优点外，FNAs还有许多优越的特性，包括核酸适配体对靶标的高结合亲和力，可用作靶向配体；DNA酶特异性的基因编辑能力，可精准识别靶标。这些特点使FNAs成为近几年的热点材料，在分子生物学和生物化学领域取得了重大进展。
3.2.1 基于适配体调节信号输出的CRISPR/Cas-等温扩增检测系统
使用ssDNA调节纳米材料作为信号探针虽然取得了较大的成功，但具有灵敏度不足这一缺陷，需要探索一种简单且灵敏度高的替代方案。Wei Luyu等在目前的研究中开发了一种基于CRISPR/Cas12a和RPA结合的适配体比色生物传感器，如图5A所示，可用于超灵敏视觉检测。当存在含有大量胞嘧啶残基的Ag适配体时，溶液中原始游离Ag由于适配体结合而减少，导致与3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）的相互作用相应减少。利用这一原理，Ag-TMB的发色反应可以用适配体进行调节。这种生物传感器具有令人满意的准确性和适用性，LOD可达8 CFU/mL，更适合于细菌的鉴定与分型，实现超灵敏的快速视觉检测。
3.2.2 基于G-四链体调节信号输出的CRISPR/Cas-等温扩增检测系统
G-四链体是在阳离子诱导下由富含串联重复鸟嘌呤的DNA或RNA折叠形成的高级结构，与氯化血红素结合后具有类过氧化物酶活性，可催化ABTS显色，常作为比色信号的输出方式。基于此原理，研究人员已经开发了相应的CRISPR/Cas-等温扩增比色传感平台。Yin Lijuan等巧妙设计出一种基于智能手机读取G-四链体的CRISPR/Cas12-RPA生物测定法，用于细菌的超灵敏检测。如图5B所示，当靶标物质存在时，扩增子触发了Cas12效应蛋白对ssDNA的降解，无法催化TMB显色；当靶标物质不存在时，富含鸟嘌呤的ssDNA通过添加K + 形成稳定的G-四链体DNA酶，在血红素存在的情况下催化TMB-H 2 O 2 反应发生颜色变化，可通过肉眼或带有颜色选择器的智能手机直接观察。应用该策略，沙门氏菌的LOD为1 CFU/mL。该技术扩大了CRISPR/Cas生物传感系统的应用范围，为食品中的病原菌提供了高灵敏度、高特异性的新型检测平台，可作为食源性病原菌有效的食品安全评估工具。基于同种原理，Chen Xueyun等开发出一种CRISPR/Cas12a结合G-四链体DNA酶的视觉检测平台检测食品中的副溶血性弧菌。该原理如图5C所示，CRISPR/Cas12a-LAMP诱导G-四链体DNA酶催化底物ABTS显色，裸眼检测灵敏度为6.1×10 2 CFU/g。这种级联方法可以作为现场病原菌检测的通用生物传感策略。
CRISPR除强大的基因编辑能力外，在生物传感平台也发挥出重要作用，为开发各种食源性病原菌的分析和检测技术提供了新的策略，目前已经成为一种有效的核酸检测工具。迄今为止，利用Cas9、Cas12、Cas13效应蛋白的顺式切割活性以及Cas12和Cas13效应蛋白的反式切割活性已经开发了多种CRISPR/Cas生物传感器，基于单一效应蛋白的快速检测技术因其设计简单、响应速度快而在POCT应用中发挥了巨大潜力。将多种核酸扩增技术，如LAMP、RPA、RAA、RCA等引入CRISPR/Cas传感系统中，不仅能够极大提高检测的灵敏度和特异性，还可以将靶点从核酸扩展为蛋白质、微小核糖核酸、酶、外泌体等物质。通过结合纳米材料、适配体、G-四链体等调节信号输出方式，实现检测信号的放大，极大提高了对食源性病原菌检测的灵敏度。
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虽然目前CRISPR在快速检测领域已经取得了显著的成果，但在发展过程中仍面临许多挑战，检测系统存在一些局限性：1）基于CRISPR/Cas的快速检测技术无法区分活死菌，易造成假阳性结果；针对这一弊端，可以采用适配体筛选出活死菌，但操作更加繁琐，在未来的研究中还需要探索出更有效的方法；2）虽然具有靶点触发侧支切割活性的Cas12、Cas13、Cas14具有良好的灵敏度，但对于复杂的食品基质仍需要超高灵敏度的检测手段，在未来的检测中可以建立联级CRISPR/Cas系统；3）CRISPR/Cas对于食源性病原菌仍停留在单一检测阶段，检测效率低，实现单一体系下的多重检测对于食品安全至关重要，在未来的研究中应该在多重检测方面寻找新的解决方法，实现多重检测过程的简便化；4）目前大多数CRISPR/Cas技术在检测前需要对核酸进行预扩增，限制了实际应用，为避免预扩增步骤，已经开发了许多一步法CRISPR/Cas检测平台。基于等温扩增的CRISPR/Cas系统展示了其优越的性能，为食源性病原菌的检测提供了新方法，在食品安全控制、分子诊断、环境检测等领域将发挥更广阔的应用潜力。
本文《CRISPR/Cas-等温扩增技术在食源性病原菌检测中的研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷7期310-321页. 作者：张琪，庞立冬，苏群超，宋丹靓敏，杨鑫焱，姜毓君，张微. DOI:10.7506/spkx0804-033. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与陕西师范大学、新疆农业大学、浙江海洋大学、甘肃农业大学、大连民族大学、西北大学于2024年10月14-15日在陕西西安共同举办“2024年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。
为加强企业主导的产学研深度融合，促进食品科研成果转化和服务地方经济产业，由全国糖酒会主办，北京食品科学研究院、中国食品杂志社和中粮会展（北京）有限公司承办的“食品科技成果交流会”将于2024年10月29-31日糖酒会期间在深圳国际会展中心举办 ，以当前食品科技发展趋势和食品产业发展的重点科技需求为导向，针对食品产业发展面临的重大科技问题，交流和借鉴国外经验，为广大食品科研工作者和生产者提供新的思路，指明发展方向。
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